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研究_以大港油田板873储气库为例

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研究 大港 油田 873 储气库
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  [收 稿 日 期 ] 2010202210[基 金 项 目 ] 中 国 石 油 天 然 气 集 团 公 司 创 新 基 金 项 目 (07。[作 者 简 介 ] 张 凡 (19802) , 女 , 2002 年 江 汉 石 油 学 院 毕 业 , 博 士 生 , 现 主 要 从 事 石 油 微 生 物 学 方 面 的 研 究 工 作 。气 库 上 方 土 壤 中 甲 烷 氧 化 菌 群 落 研 究— — — 以 大 港 油 田 板 873 储 气 库 为 例张   凡   (中 国 地 质 大 学 (北 京 ) 能 源 学 院 , 北 京 100083)佘 跃 惠 , 舒 福 昌 , 孔 淑 琼 , 周 玲 革   (长 江 大 学 化 学 与 工 程 学 院 , 湖 北 荆 州 434023)候 读 杰   (中 国 地 质 大 学 (北 京 ) 能 源 学 院 , 北 京 100083)[摘 要 ] 利 用 基 于 甲 烷 氧 化 菌 (功 能 基 因 隆 建 库 以 及 变 形 梯 度 凝 胶 电 泳 (D 分 子 生态 学 方 法 来 研 究 已 知 的 大 港 油 田 天 然 气 库 上 方 土 壤 样 品 甲 烷 氧 化 菌 群 落 多 样 性 。 构 建 了 同 一 取 样 点 不 同深 度 土 壤 样 品 5 个 甲 烷 氧 化 菌 功 能 基 因 因 克 隆 建 库 , 所 有 的 克 隆 都 属 于 甲 烷 氧 化 菌 。 克 隆 文 库结 果 显 示 同 一 剖 面 不 同 深 度 土 壤 中 优 势 菌 群 有 所 不 同 : 优 势 菌 甲 基 弯 曲 菌 属 (出现 在 所 有 的 5 个 克 隆 文 库 中 。 甲 基 孢 囊 菌 属 (在 文 库 中 所 占 得 比 例 从 11 % (D 上 升到 30 % (D , 在 文 库 D 到 31 % , 接 着 下 降 4 % ( D , 在 文 库 D 有 发 现 甲 基 孢 囊 菌 属(。 D 泳 图 也 同 样 显 示 出 以 上 的 甲 烷 氧 化 菌 菌 群 的 变 化 。[关 键 词 ] 甲 烷 氧 化 菌 因 ; 甲 烷 氧 化 菌 群 落 ; 克 隆 文 库 ; 变 性 梯 度 凝 胶 电 泳 (D 中 图 分 类 号 ] 文 献 标 识 码 ] A     [文 章 编 号 ] 100029752 (2010) 0320364205在 油 气 藏 压 力 的 驱 动 下 其 轻 烃 气 体 持 续 的 向 地 表 作 垂 直 的 扩 散 和 运 移 , 土 壤 中 的 专 性 微 生 物 以 轻 烃作 为 唯 一 的 能 源 , 在 油 气 藏 正 上 方 的 土 壤 中 非 正 常 发 育 并 形 成 微 生 物 异 常 [1 ] 。 微 生 物 油 气 勘 探( , il 技 术 通 过 检 测 这 种 异 常 进 而 预 测 下 伏 油 气 藏 的 存 在 。 甲 烷氧 化 菌 是 以 甲 烷 作 为 唯 一 碳 源 和 能 源 的 细 菌 , 常 被 用 来 作 为 的 指 示 菌 [2 ,3 ] 。传 统 的 技 术 是 利 用 微 生 物 计 数 、 富 集 培 养 、 分 离 以 及 微 生 物 代 谢 产 物 的 生 理 、 生 化 分 析 来 研究 土 壤 中 甲 烷 氧 化 菌 的 异 常 , 从 而 预 测 油 气 藏 的 存 在 [4~ 6 ] 。 但 是 , 研 究 表 明 , 可 培 养 微 生 物 仅 占 自 然 界 微生 物 的 011 %~ 15 %左 右 [7 ] , 而 且 能 培 养 的 甲 烷 氧 化 菌 有 130 多 种 , 传 统 培 养 方 法 得 到 的 甲 烷 氧 化 菌 为 混合 菌 , 不 能 确 定 其 种 属 , 因 此 仅 通 过 研 究 可 培 养 的 甲 烷 氧 化 菌 异 常 来 预 测 下 伏 油 气 藏 的 存 在 是 不 全 面 的 、不 精 确 的 。 分 子 生 态 学 方 法 就 是 在 未 培 养 基 础 上 通 过 系 统 发 育 以 及 功 能 基 因 探 针 的 方 法 来 直 接 分 析 土 壤 样品 中 的 甲 烷 氧 化 菌 [8 ] 。 甲 烷 氧 化 菌 的 功 能 基 因 常 被 用 来 检 测 甲 烷 氧 化 菌 的 存 在 和 数 量 [9 ] 。 甲 烷 氧 化 菌 的 功能 基 因 包 括 : 这 些 功 能 基 因 分 别 编 码 颗 粒 状 甲 烷 单 加 氧 酶 基 因 、 可 溶 性 甲 烷 单 加氧 酶 基 因 以 及 甲 醇 脱 氢 酶 基 因 [10 ] 。 在 这 些 功 能 基 因 中 因 存 在 于 除 外 的 所 有 已 知 的甲 烷 氧 化 菌 中 。 因 此 因 被 广 泛 的 运 用 于 环 境 样 品 中 甲 烷 氧 化 菌 的 检 测 与 定 量 [11 ] 。通 过 分 子 生 态 学 的 方 法 如 克 隆 建 库 和 梯 度 凝 胶 电 泳 (D 方 法 , 研 究 了 已 知 气 库 上 方 的 土 壤 样品 中 的 p 因 , 对 样 品 中 的 甲 烷 氧 化 菌 进 行 群 落 分 析 , 从 而 确 定 不 同 深 度 土 壤 中 优 势 菌 群 变 化 和天 然 气 微 渗 漏 特 异 性 指 示 菌 。1   材 料 和 方 法111   取 样样 品 取 自 中 石 油 大 港 油 田 (天 津 ) 板 876 储 气 库 上 方 土 壤 中 。 取 样 点 距 注 气 点 板 876 井 为 100m。·463·   石 油 天 然 气 学 报 (江 汉 石 油 学 院 学 报 ) 2010 年 6 月气 层 受 构 造 控 制 , 气 水 界 面 在 2244m 处 , 气 藏 气 层 平 面 上 分 布 连 片 , 连 通 性 好 , 气 层 有 效 厚 度 112~1114m , 碾 平 厚 度 416m , 为 构 造 气 藏 。 含 气 高 度 24m , 天 然 气 相 对 密 度 为 016264 (设 空 气 的 密 度 为1) , 其 中 甲 烷 含 量 为 90 %。 分 别 在 纵 向 剖 面 上 015、 110、 115、 210m 以 及 215m 深 处 取 5 个 土 壤 样 品 。样 品 立 即 送 往 实 验 室 20 ℃ 保 存 。112   样 品 处 理 以 及 D 取将 新 鲜 土 壤 样 品 土 块 碾 碎 充 分 混 匀 , 每 个 样 品 秤 取 等 量 015g 样 品 3 份 , 按 it 1 ) 试 剂 盒 说 明 提 取 样 品 总 将 每 个 样 品 的 3 份 合 到一 起 用 度 测 定 仪 定 所 提 取 的 度 。113   甲 烷 氧 化 菌 功 能 基 因 p 隆 文 库 建 立11311   甲 烷 氧 化 菌 功 能 基 因 p 增扩 增 甲 烷 氧 化 菌 功 能 基 因 p 物 为 5′ 2) 和 ′ 2 T ) [11 ] 。 扩 增 体 系 25μ l , 其 中 模 板 μ l (1~ 10。 通 过 序 来 实 现 对 甲 烷 氧 化 菌 功 能 基 因 p 扩 增 [11 ] 。11312   克 隆 建 库甲 烷 氧 化 菌 功 能 基 因 p 增 产 物 通 过 it 10 试 剂盒 进 行 扩 增 片 断 的 割 胶 纯 化 。 根 据 p U 试 剂 盒 的 说明 将 纯 化 后 的 扩 增 片 段 与 p 体 连 接 , 连 接 好 的 产 物 根 据 说 明 书 的 要 求 转 化 到 感 受 态 细 胞 中 , 每 个 克 隆 文 库 随 机 挑 取 100 个 白 斑 。 直 接 以 菌 体 为 模 板 通 过 通用 引 物 验 证 阳 性 克 隆 。 含 有 目 的 片 断 的 扩 增 产 物 根 据 ( 和 ( 行 核 糖 体 增 片 段 的 限 制 性 内 切 酶 分 析 (分 型 , 将 两 种 酶 切 图 谱 相 同 的 克 隆 归 为 一种 发 育 类 型 (O 。 根 据 同 一 取 样 点 不 同 深 度 土 壤 样 品 构 建 了 5 个 甲 烷 氧 化 菌 功 能 基 因 p 因 克隆 建 库 D D D D D 1313   文 库 库 容应 用 析 软 件 对 克 隆 文 库 的 库 容 饱 和 度 进 行 分 析 , 以 检 测 建 立 的 克 隆 文 库 是 否 已 经 足够 全 面 地 代 表 了 落 的 多 样 性 。11314   测 序 和 构 建 系 统 发 育 树挑 取 A 型 归 为 一 类 的 克 隆 37 ℃ 培 养 20h 后 送 往 测 序 公 司 (诺 赛 基 因 , 北 京 ) 。 所 得 序 列 通过 件 进 行 处 理 , 处 理 后 的 序 列 在 数 据 库 中 比对 分 析 , 寻 找 亲 缘 关 系 最 近 的 序 列 用 件 构 建 系 统 发 育 树 。114   变 形 梯 度 凝 胶 电 泳11411   甲 烷 氧 化 菌 功 能 基 因 扩 增 甲 烷 氧 化 菌 功 能 基 因 p 物 为 5′ 2 ) 和 5′ 2 ) 增 体 系 和 程 序 参 考 11311。11412   基 因 组 总 D 6S A 扩 增 片 段 变 性 凝 胶 梯 度 电 泳 ( D 烷 氧 化 菌 功 能 基 因 p 段 通 过 D 分 离 来 研 究 微 生 物 群 落 。 聚 丙 烯 酰 胺 的 变性 梯 度 范 围 为 40 %~ 60 % , 增 产 物 上 样 量 为 200 120V , 1 × 缓 冲 液 中 电 泳 6h ; 电 泳 完毕 后 用 (1 × , 1 ∶ 10000) 染 色 30 通 过 成 像 系 统 来 成 像 。11413   割 胶 回 收 主 要 条 带将 D 谱 上 的 主 要 条 带 割 胶 回 收 , 回 收 的 条 带 浸 泡 在 50μ l 的 无 菌 水 中 4 ℃ 过 夜 , 取 1μ l 为 模板 按 甲 烷 氧 化 菌 功 能 基 因 p 增 体 系 和 程 序 再 次 扩 增 。 通 过 it 10 试 剂 盒 进 行 扩 增 片 断 的 割 胶 纯 化 。 根 据 p U 试 剂 盒 的 说 明 将 纯 化 后 的 扩 增 片 段 与 p 体 连 接 , 连 接 好 的 产 物 根 据 说 明 书 的·563·第 32 卷 第 3 期 张 凡 等 : 气 库 上 方 土 壤 中 甲 烷 氧 化 菌 群 落 研 究  要 求 转 化 到 感 受 态 细 胞 中 , 每 个 条 带 挑 取 5 个 阳 性 克 隆 送 往 测 序 公司 测 序 。11414   割 胶 回 收 条 带 测 序 结 果 分 析测 序 所 得 序 列 通 过 件 进 行 处 理 。 处 理 后 的 序 列 在 数 据 库 中 比 对 分 析 , 寻 找 亲 缘 关 系 最 近 的 序 列 , 条 带 所 代 表 的 甲 烷 氧 化 菌 为 5 个 克 隆 中 占 多 数的 甲 烷 氧 化 菌 的 比 对 结 果 。2   结     果211   克 隆 文 库 的 库 容图 1   不 同 深 度 土 壤 甲 烷 氧 化 菌 功 能 基 因 文 库 的 析5 个 克 隆 文 库 的 线 在 检测 到 90 个 的 阳 性 克 隆 子 的 时 候 到 达 渐 近 线水 平 或 趋 于 平 缓 (图 1) , 表 明 克 隆 文 库 中p 因 的 多 样 性 已 经 基 本 上 代 表 的 结 构 多 样 性 。212   甲 烷 氧 化 菌 群 落 结 构气 库 上 方 一 个 剖 面 不 同 深 度 的 土 壤 样 品中 甲 烷 氧 化 菌 (系 统 发 育 分 类 结 果 见图 2 , 所 有 508 入 片 段 都 属 于 甲 烷 氧 化菌 。 落 分 布 随 着 土 壤 深 度 的 不 同 而出 现 差 异 (表 1) 。 015m 土 壤 样 品 中 优 势 菌为 甲 基 弯 曲 菌 属 ( (67 %) ;图 2   不 同 深 度 土 壤 甲 烷 氧 化 菌 功 能 基 因1 犿 土 壤 样 品 中 的 优 势 菌 群 为 甲 基 弯 曲 菌 属((38 %) 和 甲 基 孢 囊 菌 属((30 %) ; 115m 土 壤 样 品 中的 优 势 菌 群 为 甲 基 弯 曲 菌 属 (59 %) 和 甲 基 孢 囊 菌 属 ( 31 %) ; 2m 土 壤 样 品 中 甲 基 弯 曲 菌 属((87 %) 占 绝 对 优 势 。 215 样 品 中 在 其 他 深 度 土 壤 中 很 少 出 现 的 甲基 细 菌 属 ((58 %) 占 主 要优 势 , 同 时 甲 基 弯 曲 菌 属 ( 38 %) 也 有 一 定 的 优 势 。 从 这 一 剖 面 不 同深 度 土 壤 样 品 的 5 个 p 因 克 隆 文 库 可知 甲 基 弯 曲 菌 属 (在 这 些 土壤 样 品 中 都 存 在 并 占 有 一 定 的 比 例 , 属 于 优势 菌 群 。 甲 基 孢 囊 菌 属 ( 在015m、 1m 和 115m 土 壤 中 都 有 出 现 , 随 着深 度 的 增 加 所 占 优 势 也 增 加 (11 % ~ 30 %~ 31 %) , 但 是 随 着 土 样 深 度 的 增 加 2m 与215m 土 样 中 甲 基 孢 囊 菌 属 ( 处 于 劣 势 菌 群 。 因 此 可 以 将 监 测 1m 到115m 深 度 间 土 壤 的 甲 基 孢 囊 菌 属 (的 异 常 作 为 微 生 物 油 气 田 勘 探 的 重 要 指 标 。·663·   石 油 天 然 气 学 报 (江 汉 石 油 学 院 学 报 ) 2010 年 6 月213   D 带 分 析甲 基 弯 曲 菌 属 (在 所 有 土 样 中 的 D 谱 中 都 出 现 , 根 据 D 谱 的 亮 度 变化 , 能 直 观 看 出 该 菌 在 各 样 品 中 所 处 的 地 位 。 甲 基 孢 囊 菌 属 (在 015m、 1m 和 115m 土壤 中 都 有 出 现 , 随 着 深 度 的 增 加 , D 带 的 亮 度 增 加 , 证 明 甲 基 孢 囊 菌 属 ( 所 占优 势 也 增 加 , 但 是 随 着 土 样 深 度 的 增 加 , 2m 与 215m 土 样 中 甲 基 孢 囊 菌 属 D 带 亮 度 降 低 , 表 明该 菌 在 其 所 处 的 微 生 物 群 落 中 诸 于 劣 势 地 位 。 D 果 与 克 隆 建 库 结 果 一 致 , 并 且 能 更 直 观 地 表 现出 微 生 物 菌 群 的 变 化 。·763·第 32 卷 第 3 期 张 凡 等 : 气 库 上 方 土 壤 中 甲 烷 氧 化 菌 群 落 研 究  3   结     论1) 甲 烷 氧 化 菌 p 因 克 隆 建 库 和 D 谱 分 析 , 清 晰 给 出 了 大 港 气 库 不 同 深 度 (015~215m) 土 壤 样 品 中 的 落 多 样 性 , 指 出 不 同 深 度 土 壤 样 品 中 的 优 势 菌 和 弱 势 菌 , 根 据 甲 烷 氧 化菌 菌 群 变 化 来 确 认 该 区 域 甲 烷 氧 化 菌 的 异 常 。2) 传 统 的 方 法 中 以 培 养 方 法 来 分 析 土 壤 中 的 甲 烷 氧 化 菌 。 大 量 的 研 究 表 明 目 前 大 量 的 甲 烷氧 化 菌 在 实 验 室 厌 氧 管 中 是 不 能 生 长 的 。 同 时 随 着 土 壤 取 样 深 度 的 增 加 , 实 验 室 模 拟 长 环 境 的困 难 性 也 增 加 。3) 通 过 克 隆 文 库 比 对 结 果 分 析 , 大 多 数 序 列 和 已 培 养 的 相 似 性 很 低 (90 %~ 96 %) , 分 析结 果 进 一 步 证 明 实 验 室 环 境 下 不 易 培 养 的 。4) 运 用 基 于 甲 烷 氧 化 菌 p 因 未 培 养 的 分 子 生 物 学 方 法 能 快 捷 地 揭 示 研 究 区 块 的 甲 烷 氧 化 菌群 落 分 布 。 这 一 结 果 能 为 微 生 物 油 气 勘 探 () 提 供 更 为 准 确 、 更 为 有 效 的 数 据 。[参 考 文 献 ][ 1 ] 王 冰 冰 , 李 治 平 1 油 气 微 生 物 勘 探 技 术 的 应 用 历 史 及 前 景 分 析 [J ] 1 内 蒙 古 石 油 化 工 , 2008 , (4) : 24~ 281[ 2 ] of J ] 1 1974 , 15 : 98~ 1021[ 3 ] R , E , 1 s of on in J ] 1 2006 , 72 : 1346~ 13541[ 4 ] , J , 2 t ] 1 1998 , 23 : 118~ 1211[ 5 ] , , 1 of J ] 1 8 2002 , 11 : 453~ 4791[ 6 ] 袁 志 华 , 梅 博 文 , 佘 跃 惠 1 二 连 盆 地 马 尼 特 坳 陷 天 然 气 微 生 物 勘 探 [J ] 1 天 然 气 地 球 科 学 , 2004 , 15 (2) : 162~ 1651[ 7 ] J , T , 1 of h J ] 1 2000 , 66 : 700~ 7111[ 8 ] L , B , 1 CR of of J ] 1 2004 , 70 : 2373~ 23821[ 9 ] C , R , t he of J ] 1 1998 , 27 : 103~ 1141[ 10 ] P , T , 1 of on s of s by 6S h J ] 1 2001 , 67 : 4177~ 41851[ 11 ] , , 1 of in by CR J ] 1 2003 , 69 : 2423~ 24291[编 辑 ]   宋 换 新·863·   石 油 天 然 气 学 报 (江 汉 石 油 学 院 学 报 ) 2010 年 6 月
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