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石油微生物基因工程菌的构建

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石油 微生物 基因工程 构建
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湖北工业大学硕士学位论文石油微生物基因工程菌的构建姓名:叶长春申请学位级别:硕士专业:发酵工程指导教师:汪浩勇20090501湖北工业大学硕士学位论文摘 要石油是目前世界经济发展的命脉,石油资源的开发和利用却面临着一系列严峻的问题。微生物采油就是解决这一问题的方案之一。现在,获取采油微生物的主要方法是从自然界筛选和直接利用油层微生物,而天然的石油微生物存在着耐热、耐酸、耐盐性不高的问题。为了解决这一问题,本研究运用基因工程技术,在大肠杆菌中构建了后以转座的方式成功地将原始菌株座为阳性的石油微生物耐酸、耐高温。实验表明,以明显提高石油微生物的耐酸性,也可以提高石油微生物对高温环境的耐受性。论文初步研究了石油微生物基因工程菌的构建方法,剖析了热休克蛋白对石油微生物抗逆性的影响。为了进一步构建具有高度耐酸性,高度耐碱性,高度耐盐的石油微生物,本研究用其插入到无启动子的氯霉素抗性基因之前,。构建基因文库。其方法是用氯霉素抗性平板,筛选启动子插入为阳性的石油微生物,并对氯霉素抗性为阳性菌种进行进一步鉴定。采用本方法成功地从石油微生物油微生物启动子序列的成功分离,为进一步构建高效的石油微生物基因工程菌打下了切实可行的基础。关键词:热休克蛋白,石油微生物,质粒,大肠杆菌,基因工程菌湖北工业大学硕士学位论文is of of al e f.a of is of to of is fi?om or of in ut no at n to a of to e on on of of to of on in n to hi【of B to he of of of SP,呈交的学位论文,是本人在导师指导下,独立进行研究工作所取得的研究成果。除文中已经标明引用的内容外,本论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体,均已在文中以明确方式标明。本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名:期:用学位论文的规定,即:学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论文被查阅和借阅。本人授权湖北工业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。学位论文作者签名:时长斋日期:2口石油是中国和国外经济发展必不可少的条件之一,目前中国开发石油资源面临着一些问题。石油储量的逐步减少是当前世界面临能源危机的主要因素,而世界上各个国家对石油的需求日益增加。以我国为例,从20世纪90年代开始,石油年均消费量增长率为7.3%,而与此同时我国原油开采的增幅则不到O.4%。目前全球探明储量的石油中,以现有技术无法开采的部分有超过了50%,主要为粘度高、流动性不好的石油。因此,提高石油的采收率以及对已放弃的油田的再利用成为目前世界各国关心的重大问题。微生物采油就是解决这一问题的方案之一。现在,获取采油微生物的主要方法是从自然界筛选和直接利用油层微生物。而天然的石油微生物存在着耐热、耐酸、耐盐性不高的问题。本研究运用基因工程技术,将来自嗜热菌强烈火球菌(t'小分子热休克蛋白基因导入来自大庆油田的石油微生物石油微生物对逆环境的耐受性提高。湖北工业大学硕士学位论文第一章文献综述1.1中国石油生产的现状1.1.1中国石油生产的回顾我国石油工业的发展经历了五个时期:一是初创时期,以1938年发现玉门油田为标志;二是成长时期,一般指的是二十世纪五十年代,以一九五九年在中国东北发现大庆油田为标志;三是发展时期,一般指的是二十世纪六七十年代,从一九六五年起我国相继探明了一批油田,并且建成了胜利油田、大港油田、长庆油田等一批油田,其中就有我省的江汉油田,我国的原油年产量迅速增长,一九七八年我国原油产量首次突破国从此成为世界主要产油大国之一;四是平稳发展时期,一般指的是二十世纪八十年代,这一阶段我国石油工业的重点是将原油产量稳定在二十世纪六七十年代,中国已经探明的石油储量和原油的生产能力相当于建国后30年间已经探明的石油储量和原油的生产能力的总和;五是战略转移时期,一般指的是二十世纪九十年代到现在为止,在20世纪九十年代初,我国提出了稳定东部油田、发展西部油田、开发海洋油田、开拓国际市场的战略指导思想。我国东部的油田成功实现了高产稳产,特别是大庆油田近30年原油的年产量连续超过5000万吨,这在世界上也是不多见的;在我国西部的油田和海上新开发的油田、我国在国外所开发的一些油田正在逐步成为中国的油气资源的战略后备基地【l】。在2000年底,我国石油储量大约为1000亿吨,我国在内陆的石油储量接近780亿吨,我国在海上的石油储量接近250亿吨;据估计我国最终可开采的石油储量不到约为170亿吨。当前我国探明油田的数量是560个,已经建成了25个油田。在2007年,我国共生产原油1.87亿吨,在世界石油生产的国家和地区中,我国排名第5t¨。1.1.2中国石油生产存在问题1.1.2.1石油资源相对不足,石油储量难以增长我国的最终石油可开采的储量即使按170亿吨来计算也只占全球石油可开采的储量的4%;我国人均拥有石油最终可采资源量不到世界人均水平1/5。需要探明的可以开采石油储量占最终可开采的石油储量的3/5。粘度大的石油储量和低渗2湖北工业大学硕士学位论文透石油储量占到石油总储量的44%,这些石油在地下埋藏较深,勘探难度大,开采的技术要求高。从最近几年我国所探明的增长石油储量的情况来看,大约65%的石油增量来自于已开发油田,增长潜力相当有限。1.1.2.2主要油田石油生产进入稳产后期我国的石油生产主要集中在东部地区,东部地区的石油年产量占到全国石油年产量的2/3。但是东部地区的主要油田的石油开采已进入高含水、高采出程度和高采油速度的“三高’’阶段。特别是大庆油田近30年原油的年产量连续超过5000万吨,现已逐年递减,大庆油田2008年原油产量已减至4千万吨【¨。1.1.2.3中国的石油安全局势面临严峻挑战石油安全保障问题,关系着国家的经济安全,影响千家万户的利益也关系到政治的稳定。我国经济的高速增长离开了石油是不行,无论军事、民用还是工业、运输,石油都是无法用其他燃料的。如果石油供应中断,就会造成国家经济运行灾难。当前,我国石油产量只能满足国内的部分需求,而不得不从中东、非洲以及南美洲大量进口,一旦石油进口出现问题,对我国石油安全保障会受到严峻挑战。1.1.2.4中国石油的性质我国主要石油的性质是含蜡量较高,凝固点高。而大庆石油的性质也是含蜡量高,凝固点高,硫含量低,属于低硫石蜡基类原油。也正是由于我国具有这样的特性使得中国石油开采难度大,生产成本居高不下,特别是许多埋藏较深石油由于生产成本问题,只有不得不停止开采。由此看来必须通过高科技解决这一困境,而微生物采油正是解决方案之一。1.2解决困境的方法——微生物采油1.2.1什么是微生物采油微生物采油是指将分离出来的石油微生物和石油微生物培养液注入油井,或单纯注入石油微生物培养液或分离出来的石油微生物,使石油微生物在油层内生长繁殖,产生有利于提高采收率的代谢产物,以提高油田采收率的采油方法,也称微生物强化采油(由于微生物采油这项技术可以提高原油采收率,微生物采油这项技术对于我国减少对进口石油的过度依赖,实现石油资源的可持续利用,有着重要意义,也是保障国家石油安全,保持经济3湖北工业大学硕士学位论文可持续发展的迫切需要。用于采油的微生物可分为油层中本身含有的微生物和从外部注入的微生物。油层中本身含有的微生物中有好氧菌和厌氧菌之分,前者的容易生长,可以分解烃类物质,降低石油质量,而厌氧菌不仅容易分解烃类,还可以产生有机酸、有机溶剂、气体等,更加有利于提高原油采收率。但是由于石油中缺少营养成分,油层中本身含有的微生物的生长繁殖受到限制,可以向油层中注入微生物培养基促进微生物的生长。可供选择的采油微生物的种类很多,它们可以在地面上培养到有足够的数量后再注入油井中,能更快发挥作用,减少封井时间。1.2.2微生物强化采油技术的发展现状1.2.2.1微生物强化采油技术国外发展现状1926年,】最早提出了用微生物提高原油的产量的想法,关于微生物在原油中应用的第一项重大研究是1940年代进行的,主要研究了厌氧的硫酸盐还原菌从砂体中释放原油的机理,1949年第一次报道了这些实验,提出了硫酸盐还原菌可以提高实验室模型系统的石油采收率,这一先导性工作对以后微生物用于石油开采的发展起到了很大影响。国、前苏联及一些前东欧的社会主义国家如罗马尼亚、保加利亚等国家相继进行了微生物强化采油的工业级试验,试验结果表明,可以利用微生物提高石油采收率。1970年代初出现世界石油危机后,美、英等国加快了微生物强化采油技术的研究步伐。1982年在美国俄克拉荷马州召开了有34个国家参加的“世界微生物采油会议",与会各方系统交流了多年来各自的研究成果,并决定今后每两年召开一次微生物采油的国际会议【41。1986年,美国微生物采油这项技术得到迅速发展。1987年,生物强化采油的成功率达70%以上,所增产原油提高10%,51。微生物采油技术逐渐从实验室走向应用阶段。1990年代微生物强化采油技术在美国、前苏联的矿场应用标志着工业性应用阶段的到来。近十几年来,微生物强化采油技术已经在更多国家的石油开采中得到应用,取得了很好的经济效益,同时许多大学和石油公司的实验室也加大了微生物强化采油技术的研究和开发力度,取得了许多可喜的成果【6】。1.2.2.2微生物强化采油技术在中国的发展现状我国早在1966年,新疆石油管理局就开始利用微生物进行原油脱蜡技术的研究,1986年开展了微生物稠油脱蜡技术的研究工作【71。1990年后,我国加快了微4湖北工业大学硕士学位论文生物采油技术的研究步伐,研究出的新菌种能使原油的界面张力降低60%,新菌种能够承受24河油田锦州采油厂1995年首先进行了将微生物处理技术用于稠油中含有的胶质、沥青胶质组分的研究,1996年进入矿场试验阶段,在1996年到1997年这两年间,辽河油田锦州采油厂先后在辽河油田进行微生物强化采油技术试验26井次,获得了一定成功。扶余采油三厂从1992年6月起到1995年5月为止,扶余采油三厂在86口油井中应用了微生物强化采油技术,有79%的油井采油量增加,采油量平均提高2倍,原油增产超过999年,胜利油田的6个采油厂在77口油井中应用了微生物强化采油技术,累计增产石油超过1万吨,单井采油量平均增加148吨,投入产出比超过l:9,获得了良好的经济效益[71。2000年底,胜利油田东辛采油厂引进了美国胜利油田的验结果显示,微生物强化采油技术的使用使得比水驱提高5%,增加可采储量1万8千吨,试验当年增产石油615.5吨【引。2002年5月,我国在山东东营动工兴建目前中国最大的微生物采油厂,这个微生物采油厂将会对我国微生物强化采用技术的发展起到巨大的推动作用【9】。近几年来,我国先后从美国、加拿大引进石油微生物菌种和微生物采油技术,以推动我国微生物采油技术的发展。进行微生物采油技术前期试验的油田逐步增加,微生物采油技术的推广速度逐步加快。我国在新疆的克拉玛依油田、东北的大庆油田、扶余油田、大港油田、胜利油田、冀东油田、辽河油田、江汉油田等油田开展了微生物采油技术的推广应用,微生物采油技术前期试验进行井次超过2千。微生物采油技术试验由单井向整个油田试验进行;由浅层含油带向中深层含油带进行;由高渗油井向中、低渗油井进行;由低温油井向高温油井进行(最高温度为102℃);由低含水油井向高含水油井进行(最高含水80%);由原油中的中长链烷基向长链烷基发展,最长可达到井采油量一般提高40%"70%,投入产出比超过1:4,经济效果显著。油井增产的最佳有效期8个月~12个月(最高达18个月)。在现场试验中,每次单井平均加注菌种量为110L"-'150L,最高为420其他提高采收率的方法相比,利用微生物采油技术是当今比较有发展前景的一项采油技术,尤其在我国目前陆上油田大多进入高含水阶段,利用微生物采油技术提高采收率应是当务之急。1.2.3微生物强化采油机理就目前来说,微生物强化采油的机理尽管复杂,但是可以归纳为以下几个方面:(1)石油微生物在生长过程中,石油微生物可以将石油中的重质组分分解为湖北工业大学硕士学位论文轻质组分【川,将大分子烃类物质分解为低分子的烃类物质【12】,改善石油的流动性以达到降低石油粘度的目的;(2)石油微生物在油田内所进行的分解活动会生成大量的二氧化碳、氢气、氮气等气体,这些气体能够提高油层内部的压力,促进原油的溶解,使原先断断续续原油富集,便于开采【13】;(3)石油微生物的代谢能够分解原油,生成低分子量的醇、脂肪酸、糖脂、生物表面活性剂等物质,这些物质会降低油水界面的表面张力,使原油的流动性能得到改善【141;(4)微生物代谢产生的生物聚合物可以堵塞渗透率较高的岩石层,驱使石油流向渗透率较小的岩石层,提高微生物强化采油效果;(5)石油微生物代谢过程中产生的酸性物质能溶解岩石,改善油层渗透性;(6)微生物中的厌氧菌分解石油后产生的溶剂能溶解石油,使石油从岩石表面释放【151。利用微生物提高采收率主要有三种方式【16】:一是石油微生物具有清理石蜡和降低石油的粘度的能力。大多数细菌对蜡质脂肪烃的分解速度高于对芳香烃的分解速度【171,细菌在代谢过程中产生的溶剂【18是石油微生物选择性封堵地层。把能产生生物聚合物的微生物注入地下,或向地层注入适当的石油微生物培养液,促使石油微生物在高渗透的油层内大量繁殖,产生多糖,石油微生物繁殖过程中产生的多糖可以对高渗透的地层起到封堵作用;三是周期性地向油井注入在地面上培养的石油微生物。将地面上培养的石油微生物、石油微生物培养液注入油井内,停止生产一段时间,然后开再开采石油,石油开采一段时间后,石油产量会下降,这时再次进行上述工作。1.2.3.3石油微生物采油存在的问题:石油微生物的生长需要一定的生存条件,使用微生物采油技术必需选择适宜的油层。这些生存条件包括石油的温度、石油的压力、地层水的矿化度、石油的渗透率、含油饱和度、石油的油相对密度等【19】。(1)对采油微生物而言,在所有的影响因素中,油井的温度是最为重要的一个因素。高温会引起微生物生长缓慢,甚至导致其死亡【捌。油层温度在以3012到50"生物强化采油成功率往往较高,利用嗜热菌可以在油层温度为80℃"条件下进行微生物强化采油。美国在犹他州A//仍可以提高石油产量【23】。(2)石油的埋藏深度与石油的温度有一定的相关性,能够进行微生物强化采油的油层,其深度一般不到1500米,匈牙利曾经成功地在深达2457米深的油层进行了微生物强化采油。美国也在犹他州A/油层深度高达3000米"5500米瞄】。(3)地层水含有多种盐分,地层水所含盐分的90%以上是此导致地层水矿化度较高。地层水的矿化度是影响采油微生物生长的重要因素之一。矿化度过高对微生物生长不利,只有少数细菌对高浓度盐水具有承受能力【24】。(4)和其它生存条件相比,油层的压力对于细菌的生长影响不大。1051,如果其它生存条件不理想,如石油的层压力对细菌的正常生长会构成影响。(5)原油的性质是一个对采油微生物生长有重要影响的因素之一。原油性质对微生物生长的影响主要有两个方面:一是原油中易挥发的轻质组分对微生物具有毒性,原油中碳数少于10的烷烃类组分都可能会对微生物产生毒害作用【211,烷烃类组分对微生物的毒害强弱因微生物种类而异;二是原油中的沥青等重质组分对微生物的活动产生不利影响【221。所以要求原油的对密度)大于18度。(6)大多数油藏"范围内【231。(7)细菌在油层中的运动,要求油层渗透率应该大于0.061.1隙度应大‘于17%,否则将会对细菌在油层中的运动构成不利的影响【261。国内常用微生物采油技术适用的油层条件标准为:1)油层温度要小于120℃;2)油层渗透率要大于0.061)地层水矿化度要小于1 509/L;4)原油粘度要小于4【271。为了解决以上问题,本研究运用基因工程技术,提高了石油微生物对酸性、高温,高盐等逆环境的耐受性,并取得一定成绩。1.3构建石油微生物基因工程菌的技术方案本论文旨在通过基因工程手段【28】将运动发酵单胞菌(丙酮酸脱羧酶基因(乙醇脱氢酶基因(29】克隆并导入到石油微生物中,在基因工程菌中建立各种新的代谢途径,并进一步克隆导入了来自于超嗜热菌强烈火球菌(小分子热休克蛋白基因【30l,进一步研究它对生产石油的基因工程菌的抗逆性的作用。研究当石油基因工程菌处于逆境时,其生长会受到抑制,存活率降低,通过表达来自超嗜热菌强烈火球菌的小分子热休克蛋白基因,使石油基因工程菌大大增强了对逆境的抗性。7湖北工业大学硕士学位论文第一步:乙醇脱氢酶基因(超嗜热菌强烈火球菌(小分子热休克蛋白基因。第二步:将丙酮酸脱羧酶基因(乙醇脱氢酶基因(联构建载体热休克蛋白基因(却)与将丙酮酸脱羧酶基因(乙醇脱氢酶基因(联构建构建四步:使用转座技术将而构建出所需基因工程菌1.4热休克蛋白1.4.1什么是热休克蛋白热休克蛋白(生物体对外界刺激迅速作出的应激反应,将正常的基因表达关闭,开启一组应激基因的表达,产生一组在结构上非常保守的特殊蛋白质【3生物体能够快速地在短时间内对应激过程中细胞的存活机制进行调整,促进细胞抗损伤,并有助于细胞恢复正常的结构和机能。从而使生物体在热、冷、高盐、有机毒物、重金属离子、氧自由基、紫外线及缺血、缺氧、感染、基因损伤、组织创伤等不良环境和状态下生存下来【32】。上世纪70年代以来.热休克蛋白的研究一直是个热点,陆续发现各种热休克蛋白,主要有分子伴侣、白酶、多数热休克蛋白是分子伴侣,热休克蛋白常可分为5大类:00(分子量为800(分子量为8260(分子量为6760(分子量为58 5子量为40331。近年来,对古菌热休克蛋白的研究也有了一定的进展【341。古菌可分为极端嗜热古菌(存的温度在80。8湖北工业大学硕士学位论文嗜温古菌(存的温度在30℃~60℃),嗜热古菌(存的温度在60"C')。对于极端嗜热菌,能生活在近100℃的环境中,有多种耐热机制,但产生大量热休克蛋白是一种重要的手段。极端嗜热菌不含00和0,只含有0(‘0(温古菌可能含有的热休克蛋白在极端嗜热菌中几乎不含有,即仅包括0,小分子热休克蛋白(前折叠素(白4大类。小分子热休克蛋白分子量为12 其他大分子热休克蛋白相比,小分子热休克蛋白的存在似乎对细胞来说并不是必不可少的。但是,小分子热休克蛋有多种功能,包括赋予细胞以耐热的能力以帮助细胞抵抗高温,作为分子伴侣以防止细胞内的蛋白质产生聚集,导致正常细胞死亡,从而调节细胞的生存和死亡的平衡。除了亚致死温度外,高盐、酸、碱、乙醇等环境压力也可诱导细胞合成热休克蛋白。1.4.2热休克蛋白逆境抗性的机制热休克蛋白提供逆境抗性的机制是基于热休克蛋白形成蛋白高级结构(蛋白折叠)的功能。也就是说,热休克蛋白能够与因逆境而变性变得无法形成正确的高级结构的蛋白结合,通过将其折叠成正确的高级结构而恢复该蛋白的正常功制35l。热休克蛋白在蛋白高级结构形成的这种功能,不仅在变性蛋白中作为分子伴侣而且也在正常细胞的蛋白装配、跨膜运输中也作为分子伴侣。当细胞处于逆境中时,热休克蛋白通过与不同的蛋白结合来发挥其功能,对逆境产生防御反应。1.4.3热休克蛋白对细胞的作用1.4.3.1热休克蛋白参与细胞耐热和细胞保护在各种细胞器中核仁和细胞膜对热特别敏感.~2005)通过构建果蝇0缺失突变体发现,是而,没有热休克蛋白70的果蝇热应激反应期延长,并且非致死性热休克后发育迟缓(时间较长)。由此表明究发现通过热应激产生的之由其它应激也能刺激而产生热耐受。例如,刘国文等采用家兔缺血再灌注模型,以微波为预处理因素检测热休克蛋白70表达及肝功能变化的情况,发现微波会诱导热休克蛋白处理组缺血再灌注后肝功能损害减轻【3引。这一事例有力证明了9湖北工业大学硕士学位论文.4.3.2热休克蛋白参与细胞抗氧化作用在应激状态下细胞的氧自由基会增多,氧自由基会导致脂质氧化并对生物膜的流动性、通透性发生巨大影响,从而对细胞及细胞器造成破坏,够催化氧自由基发生歧化反应清除自由基,清除细胞缺血再灌注过程中产生的大量自由基,对机体细胞造成不可逆的损害,氧自由基是缺血再灌注肌细胞损害的主要因素。所以上面提到的兔肝缺血再灌注中热休克蛋白70对肝脏所具有的保护功能也是对热休克蛋白70抗氧化功能的一个佐证。大量研究表明,机体细胞在受到如高热、缺氧、机械刺激等有害应激时,产生的热休克蛋白70可以使细胞提高对下一次可能出现的有害损伤的耐受程度,使细胞能够维持正常的新陈代谢的生理功能和,提高了细胞在不利条件下的生存率【391。1.4.3.3热休克蛋白70的抗细胞凋亡和坏死崔荣太,李晓华等人的研究也表明m】,热休克蛋白70与细胞凋亡的关系密切,尤其是对热休克、氧化应激、电离辐射等有害应激引起的细胞凋亡具有保护作用,其作用机制是热休克蛋白70抑制细胞的应激激活蛋白激酶的活性,抑制细胞表达凋亡基因,抑制蛋白水解酶和氧自由基生成,对细胞线粒体功能具有保护作用防止细胞凋亡。1.5工具菌种的介绍Z.性厌氧,具有圆端肥粗的杆状细胞,单个或成对,用丝生鞭毛运动,长1.412.少成短碰411。Z.只把很少量葡萄糖同化作为构造细胞用,98%的葡萄糖发酵生成乙醇,只有2%用作碳源,且只能代谢3种基质:葡萄糖、果糖、蔗糖,代谢葡萄糖采用好氧菌的21。1.5.2大肠杆菌(肠杆菌(小1p.m"肠杆菌身体四周长有鞭毛,能游动,没有芽孢。大肠杆菌能分解多种糖类,产酸、产气,是人和动物肠道中的正常栖居菌。大肠杆菌在微生物遗传研究中的起着重要作用,如局限性转导就是1954年在大肠杆菌31。莱德伯格10湖北工业大学硕士学位论文(用两株大肠杆菌的营养缺陷型进行实验,奠定了研究细菌接合方法学上的基础以及基因工程的研究的基础【431。大肠杆菌作为外源基因表达的宿主,遗传背景清楚,操作简单,对培养要求不高,倍受遗传工程专家的重视。目前大肠杆菌是在遗传工程中应用得最广泛,最成功的宿主菌。1.5.3超嗜热菌强烈火球菌(毋嗜热古生茵指的是古生菌界中能在温度高于100。们的最适生长温度一般为80。C。这种最适生长温度不仅对高等动植物是致死温度,就是对耐热的真细菌来说,也是不能存活的温度。超嗜热古生菌所分布地区大致是在地热区炽热的土壤中或含有硫元素以及硫化物热的水域中。由于生物氧化作用,富含硫的水域、热的水域及其周围环境往往呈现酸性,的些高热、高酸、高硫等极端环境,通常人们称之为硫磺热泉。但是,主要的超嗜热古生菌多栖息在弱酸性的高热地区。激烈火球菌(专性厌氧极端嗜热古细菌。于1987年在意大利火山岛附近的海滩上被发现,可生存于100℃的高盐极端环境中。这种细菌消化糖的方式与人类、动植物和细菌都不同。所有生物体都是通过糖酵解过程将葡萄糖转化成丙酮酸的。而激烈火球菌利用的却是其它与糖酵解无关的酶。研究人员发现21个与糖消化有关的基因前都存在一段相同的一段相同的已经成功地在大肠杆菌中克隆和表达了来自于超嗜热菌(&,小分子热休克蛋白的基因。发现,在105℃下,在长达40组体产生的小分子热休克蛋白阻止了大肠杆菌的大多数蛋白的聚集。,热休克蛋白明显能够使嗜常温菌(中温细菌)在高温下具有生存优势。1.5.4石油微生物石油微生物从渣油中分离出来的微生物,可以分解烷烃类化合物。湖北5引言第二章石油微生物基因工程菌的构建本研究旨在通过基因工程手段将51,构建对酸性、高温,高盐等逆环境具有一定承受力的石油微生物基因工程菌。2.2材料与方法2.2.1材料1.菌种表2.1菌种 有有却基因本研究室室保存本研究室室保存2.试剂表2.3试剂 产厂家 连)有限公司武汉分公司宝生物工程(大连)有限公司武汉分公司宝生物工程(大连)有限公司武汉分公司上海锐聪科技发展有限公司上海锐聪科技发展有限公司上海玉博生物科技有限公司湖北工业大学硕士学位论文北京原平皓生物技术有限公司武汉市合中生化制造有限公司北京原平皓生物技术有限公司北京原平皓生物技术有限公司北京原平皓生物技术有限公司北京原平皓生物技术有限公司北京原平皓生物技术有限公司安比奥生物技术公司安比奥生物技术公司武汉合联化工仪器有限责任公司武汉合联化工仪器有限责任公司武汉合联化工仪器有限责任公司武汉合联化工仪器有限责任公司上海英骏生物技术有限公司宝生物工程(大连)有限公司武汉分公司宝生物工程(大连)有限公司武汉分公司宝生物工程(大连)有限公司武汉分公司北京原平皓生物技术有限公司北京原平皓生物技术有限公司B)甘油物合成邛’氨酸蛋白质硫酸铵3仪器设备表2.4仪器设备仪器名称 厂家 产地 型号13湖北工业大学硕士学位论文可见紫外分光光度计 上海尤尼柯 中国 方法2.2.1主要的培养基的配制(1)l%蛋白胨,0.5%酵母粉,1%,121℃灭菌50于培养大肠杆菌,%琼脂。(2)509酵母提取物,0.59 匀后加入105010的,定容至100021℃灭菌203)L 葡萄糖溶液。(4)氨苄青霉素(存液:50mg/超纯水进行配制,用过滤器过滤灭菌,在.20"(2的条件下保存(工作浓度为:100pg/(5)庆大霉素(存液:50mg/n[1l,用超纯水进行配制,用过滤器过滤灭菌,在.20℃的条件下保存(工作浓度为:100119/.2.2主要溶液与缓冲液的配制(1)O.5M )9二水乙二胺四乙酸钠盐,在恒温磁力搅拌器上剧烈搅拌,用10,然后定容至10021℃灭菌60温放置。(2)10 mg/10拌至完全溶解,然后用锡纸包裹容器或转移至棕色瓶中,保存于室温。注意:溴化乙锭有毒,为致癌剂,使用时必须戴上手套。(3)19三羟甲基氨基甲烷,加入浓盐酸调节,然后加纯水定容至10021℃灭菌60温放置。(4)TE()缓冲液:10.0),1),高压灭菌。(5)50x
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